Introducción: El uso de pasteurización para extender la vida de anaquel de jugos degrada compuestos antioxidantes y nutricionales. El uso de tecnologías emergentes como el termoultrasonido, permitiría obtener un valor agregado en el jugo de zarzamora, que conserven al producto sin alterar sus características sensoriales y nutricionales. Método: Los jugos de zarzamora fueron evaluados en 3 etapas; 1) Contenido de compuestos antioxidantes y actividad antioxidante; 2) Extracción de compuestos; 3) Determinación de bioaccesibilidad intestinal in vitro de compuestos antioxidantes y actividad antioxidante. Resultados: El termoultrasonido liberó compuestos con capacidad antioxidante en el jugo; fenoles totales (1,011 mg EAG/100g), antocianinas (118 mg A/100g); y actividad antioxidante: ABTS (44 mg VC/100g) y DPPH (2,665 μmol ET/100g). El jugo termoultrasonicado presentó una fracción bioaccesible in vitro de compuestos fenólicos totales (710 mg EAG/100g), antocianinas (82 mg A/100g); con capacidad antioxidante actividad antioxidante: ABTS (44 mg VC/100g) y DPPH (2360 μmol ET/100g). Conclusión: El termoultrasonido puede ser alternativo a tratamientos térmicos para incrementar la vida útil de jugos de zarzamora, ya que conserva y libera compuestos con propiedades antioxidantes y una bioaccesibilidad intestinal importante.
Palabras clave: Zarzamora, actividad antioxidante, bioaccesibilidad intestinal.
Introduction: The use of pasteurization for extending juices shelf life of antioxidants and nutritional compounds. The use of emerging technologies such as thermoultrasound, would yield an added value in blackberry juice, to retain the product without altering their sensory and nutritional characteristics. Method: blackberry juice samples were evaluated in 3 stages; 1) Content of antioxidant compounds and antioxidant activity; 2) Separation of compounds; 3) Determination of in vitro intestinal bioavailability of the antioxidant compounds and antioxidant activity. Results: thermoultrasound released greater amounts of antioxidant compounds in the juice; total phenols (1,011 mg GAE/100g), anthocyanins (118 mg A/100g); and antioxidant activity: ABTS (44 mg VC/100g) and DPPH (2.665 µmol TE/100g). The thermoultrasonicated juice had a higher in vitro bioavailable total phenolic compounds (710 mg GAE/100g), anthocyanins (82 mg A/100g); antioxidant with antioxidant capacity: ABTS (44 mg VC/100 g) and DPPH (2360 µmol TE/100g). Conclusion: thermoultrasound can be an alternative to heat treatment to increase blackberry juice shelf life as it retains and releases compounds with antioxidant properties which increased intestinal bioavailability.
Keywords: Blackberry, antioxidant activity, intestinal bioaccessibility.
La planta zarzamora de nombre científico Rubus fruticosus pertenece al género Rubus y a la familia de la Rosaceae, es un arbusto delgado y flexible de ramas leñosas, arqueadas y espinosas, con hojas compuestas de 3 ó 5 hojas elípticas y de borde aserrado, dispuesto de forma palmeada, llega a medir hasta 2 m de alto por 7 m de longitud. Sus flores crecen en racimos compuestos con 5 sépalos y 5 pétalos blancos o rosados sobre un receptáculo ensanchado, con numerosos estambres.
Su fruto es un agregado de numerosas drupas carnosas (polídrupa), cada una contiene una semilla, las drupas presentan una forma en D, de base estrecha a punta amplia o en forma triangular redondeada, mide de 2 a 3 mm de largo por 1.5 a 2.8 mm de ancho y 1 a 1.8 mm de espesor, pesan entre 5 y 10 g por frutilla. La zarzamora es verde al principio, pasa por tonalidades rojizas y finalmente es negra brillante cuando madura (Lim, 2012; SAGARPA, 2013).
Existen factores pre y pos cosecha que influyen principalmente en el crecimiento, rendimiento y calidad de frutos de zarzamora, en climas con cambios ambientales estresantes como sequía, alta humedad, niveles altos de radiación solar, temperaturas extremas y el ataque de insectos y patógenos (Atkinson, Nestby, Ford, & Dodds, 2005; Giraldo, 2004), así como la cosecha manual en grandes extensiones, la hora del día en que se efectúa la cosecha, el transporte y su procesamiento (9), entre otras.
En México, la zarzamora es una frutilla con alta producción, en especial en los estados de Michoacán, Jalisco y Colima. Hidalgo y el Estado de México también tienen plantíos con producción menor aunque con importancia comercial.
A pesar de la gran producción que se tuvo hasta el 2013, 11,889 hectáreas y 128,976 toneladas de cosecha (SIAP, 2014), se exporta el 90% de la producción principalmente a Estados Unidos. Sólo se consume 10% en fresco de la obtención total en el territorio mexicano (Parra-Quezada, Acosta-Rodríguez, & Arreola-Ávila, 2005). Es quizá que exista un bajo consumo de este fruto debido a la escasa cantidad que queda en el país, aunado a la poca difusión y fomento al consumo de la zarzamora y por último, que los pequeños productores no cuentan con las infraestructura necesaria para su óptimo manejo y comercialización.
Los frutos de zarzamora con madurez comercial, contienen un elevado porcentaje de agua, azúcares (sacarosa 0,07 g, glucosa 2,31 g, fructosa 2.40 g, maltosa 0,07 g, galactosa 0,03 g), sólidos totales, entre otros (Acosta-Montoya et al., 2009; U.S. Deparment of Agriculture, 2011). Al igual, las zarzamoras poseen un alto contenido de pigmentos (carotenoides y antocianinas) y compuestos (ácido ascórbico y fenoles) que presentan una actividad antioxidante importante (Acosta-Montoya et al., 2009; Martínez-Cruz et al., 2011; Pantelidis, Vasilakakis, Manganaris, & Diamantidis, 2006) .
Por los compuestos anteriormente mencionados, se puede definir a la zarzamora como un fruto con propiedades antioxidantes de gran importancia, ya sea para su consumo en estados patológicos o bien para los beneficios que ofrece a la salud (Bowen-Forbes, Zhang, & Nair, 2010; Srivastava et al., 2010; Vendrame, Daugherty, Kristo, Riso, & Klimis-Zacas, 2013) .
Entre los beneficios que se le adjudican al consumo de zarzamora se encuentran: propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y propiedades quimiopreventivas, así como la actividad biológica contra cáncer oral, de esófago y de colon (Bowen-Forbes et al., 2010), hasta el mejoramiento de la memoria en adultos mayores (Krikorian et al., 2010) .
De igual forma, se corrobora en estudios epidemiológicos con animales, la disminución de nefropatía en ratas hipertensas debido a la disminución del estrés oxidativo (Elks et al., 2011) ; la protección coronaria en ratas con daño isquémico (Ahmet et al., 2009) ; en otro estudio, se observó la disminución de la inflamación en ratas con síndrome metabólico (Cotelle, 2001; Vendrame et al., 2013) , entre otros beneficios. Sin embargo, estos beneficios dependen de la cantidad de compuestos con actividad antioxidante que se absorben.
Durante el procesamiento de jugos de frutas, los tratamientos térmicos y otras condiciones físicas como la oxidación, exposición a luz, adición de azúcares, cambios en el pH y temperatura, reducen fácilmente el contenido de compuestos antioxidantes y propiedades nutricionales (Sadilova, Stintzing, Kammerer, & Carle, 2009).
Desde hace tiempo, se han utilizado tratamientos térmicos como la pasteurización y la ultra-pasteurización para extender la vida de anaquel de ciertos alimentos, procesos que operan temperaturas mayores a los 100 °C en lapsos muy cortos de tiempo (segundos). Estos sistemas térmicos son los únicos que operan por inactivación y se usan de forma mayoritaria en la industria alimentaria, sin embargo, dichos procesos modifican el “flavor” y textura de los productos frescos (S.H. Lee & G.A. Coates, 2003; Wells & Singh, 1988), así como la degradación de compuestos con capacidad antioxidante.
Actualmente existen tecnologías emergentes, como la ozonización, campo de pulsos eléctricos, alta-presión, ultrasonicación entre otros, que pueden ser utilizados en el proceso de conservación de la materia prima y de esta forma preservar sus propiedades nutricionales, así como prolongar su vida de anaquel sin que sus características se vean modificadas (Barba et al., 2012; Patras, Brunton, Da Pieve, & Butler, 2009) .
El ultrasonido es un proceso tecnológico no térmico que puede remplazar a tratamientos térmicos convencionales como la pasteurización y logra una seguridad microbiana en los jugos de frutas (Zafra-Rojas et al., 2013). Esta tecnología emergente ha sido utilizada desde hace más de 30 años en la industria alimentaria. Consiste en someter a un alimento a ondas acústicas de frecuencia superior a 20 kHz.
La implosión libera la energía acumulada, ocasionando incrementos de temperatura instantáneos y focales, que se disipan sin que supongan una elevación sustancial de la temperatura del líquido tratado. La energía liberada, así como el choque mecánico asociadas al fenómeno de implosión, afectan tanto a estructuras celulares situadas en el microentorno, como a microorganismos y en algunos casos, liberan compuestos antioxidantes con actividad biológica (Feng & Yang, 2011).
El consumo de alimentos con actividad biológica puede variar considerablemente y puede llegar a ser muy alto, pero el impacto nutricional y los efectos sistémicos subsecuentes dependen del destino que tengan los polifenoles en el sistema digestivo. Las características físico-químicas de los polifenoles dictan que debe existir una absorción y metabolismo rápido.
Los métodos in vitro sobre bioaccesibilidad, ofrecen una alternativa para el estudio en humanos y en animales, ya que son simples, rápidos, de bajo costo y pueden predecir la biodisponibilidad relativa en estudios del procesamiento en alimentos (Saura-Calixto, García-Alonso, Goñi, & Bravo, 2000).
La aplicación de modelos in vitro, consiste en una simulación de la fase inicial de la digestión intraluminal, seguido de una absorción intestinal utilizando un modelo de diálisis (Bosscher et al., 2000) . Los compuestos fenólicos son extensamente metabolizados tanto en tejidos como en el colon por la microflora (Scalbert, Morand, Manach, & Remesy, 2002).
Un estudio realizado por Anese y colaboradores (2013) (Anese, Mirolo, Beraldo, & Lippe, 2013), determinaron la influencia del tratamiento de ultrasonido en la pulpa del tomate, en donde, investigaron la bioaccesibilidad in vitro del licopeno, en este caso, la ultrasonicación fue responsable del aumento de las propiedades del tomate que la muestra sin tratamiento, aunque la bioaccesibilidad in vitro del licopeno disminuyo, quizá debido a la interacción entre compuestos propios del tomate.
Al igual, Tiwari y colaboradores (2009) (Tiwari, O’Donnell, & Cullen, 2009) realizaron un estudio en donde observaron que la aplicación de sonicación a un jugo de zarzamora, retuvo significativamente el contenido de antocianinas, de esta forma, la sonicación se puede utilizar como una técnica de preservación de antocianinas y en donde su retención es deseable en el procesamiento de la zarzamora.
Aunque en México existe una producción anual importante de zarzamora (128,976 toneladas), 90% de la producción se exporta a E.U. y el 10% se consume como fruta en fresco o de temporada. Durante el proceso pre y pos cosecha se presentan grandes pérdidas del producto debido a que la infraestructura con la que se cuenta para la comercialización de la frutilla es inadecuada.
Tratamientos térmicos convencionales como la pasteurización se han utilizado para extender la vida comercial de alimentos. Sin embargo, la aplicación de dicha técnica genera un alto consumo de energía y costos, por otra parte, ocasiona la degradación de compuestos nutricionales así como la modificación del sabor y color de los alimentos.
A fechas recientes, se han incorporado nuevas técnicas de preservación de alimentos, como la ultrasonicación, tecnología limpia que puede completarse en menor tiempo y con menor temperatura, reduciendo de esta forma el costo del procesamiento, al igual, el producto no sufre modificaciones organolépticas, razón por la que se podría omitir la adición de sustancias para conservar sus propiedades sensoriales.
Por estudios previos en diversos frutos, se ha encontrado que el ultrasonido en conjunto con un tratamiento térmico con temperatura baja, pueden ser una alternativa a utilizar que sólo la aplicación de tratamientos térmicos altos para incrementar la vida de anaquel de jugos, ya que podría asegurar una disminución importante de actividad enzimática y de carga microbiana, así como, la liberación de compuestos con propiedades antioxidantes. Aunado a esto, se podrían ofrecer nuevas presentaciones de consumo, como el jugo de zarzamora termoultrasonicado y por ende, se otorgaría un valor agregado a la zarzamora.
Determinar la concentración de compuestos antioxidantes, capacidad antioxidante, extracción por polaridad y bioaccesibilidad intestinal in vitro de estos compuestos de jugo de zarzamora (Rubus fruticosus spp.) con tratamiento de termoultrasonicación en comparación con tratamiento de pasteurización.
El jugo de zarzamora (Rubus fruticosus spp), con tratamiento de termoultrasonicación y evaluación de la bioaccesibilidad intestinal in vitro posee un alto contenido de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante.
Las zarzamoras fueron proporcionadas por productores locales de Atotonilco, Hidalgo, México, durante los meses de diciembre 2013 y enero 2014, se seleccionaron las frutas sin daños externos. Las zarzamoras fueron tamizadas con una licuadora comercial (Hamilton-Beach® modelo 67900-MX) para obtener su jugo. Se obtuvieron 3 jugos de zarzamora para realizar el presente trabajo. El primero sin tratamiento (control: CTL), el segundo pasteurizado (70 °C, 30 min: PAS) y el tercero con tratamiento por termoultrasonido (TUS) (Ultrasonic Processor VCX-1500, Sonics & Materials, USA), con las siguientes condiciones: 45 °C, frecuencia constante de 20 kHz usando una celda de flujo continuo (400 mL), amplitud de 80% durante 25 min con duración de pulso de 4 s encendido y 2 s apagado. Posteriormente, los jugos se sometieron a congelación (-32 °C) para liofilizarlos durante 4 días a -55 ± 1 °C y un vacío de 0.140 mbar.
Determinación de ácido ascórbico
Para la determinación de ácido ascórbico (AA), se empleó el método colorimétrico descrito por Dürüst y colaboradores (1997) (Dürüst, Dogan, & Dürüst, 1997a) empleando el reactivo DCPI (2,6- diclorofenolato sódico) que tiene una coloración azul-violeta y al reaccionar con el AA ocurre una decoloración a rosa tenue o incoloro. Se prepararon las siguientes soluciones: DCPI, amortiguador de acetatos al 1 M con pH de 6 y solución de AA se determinó la absorbancia (Abs) a 520 nm y se utilizó ácido oxálico como blanco al 0.4% (Dürüst, Dogan, & Dürüst, 1997b). Los resultados se expresan como miligramos de ácido ascórbico por 100 g (mg AA/100 g).
Determinación de fenoles totales
Para la determinación de compuestos fenólicos totales (CFT) se realizó por medio del método descrito por Georgé y colaboradores (2005) (Georgé S, 2005), donde a las muestras se les agrega 500 µl de Folin-Ciocalteu diluido 1:10. Después de adicionar 400 µl de carbonato de sodio se deja reposar por 30 min a temperature ambiente, se realizó la lectura de Abs a 765 nm al finalizar dicho tiempo (Georgé S, 2005). Los resultados se reportan como miligramos equivalentes de ácido gálico por 100 g (mg EAG/100 g).
Determinación de antocianinas
Para la determinación de antocianinas se empleó el método diferencial de pH descrito por Giusti y Wrolstad (2001) (Giusti & Wrolstad, 2001). Se prepararon reactivos de cloruro de potasio a 0.025 M (pH de 1.0) y acetato de sodio a 0.4 M (pH de 4.5). Se obtuvo el sobrenadante del jugo, del que se tomaron 500 μL y se vertieron con los reactivos; 4.5 mL de cloruro de potasio y 4.5 mL de acetato de sodio, respectivamente en tubos separados. Posteriormente se taparon los tubos y se agitaron en vortex para reposarlos en baño María a 25 °C durante 15 min. Concluido el tiempo, se tomaron 200 μL de cada tubo para su lectura. La absorbancia se midió a 510 nm y 700 nm para ambas placas, en donde se empleó la siguiente fórmula para el cálculo de antocianinas totales:
Antocianinas totales (mg/100 g) = (A * MW * DF * 10,000) / (E * Tc)
En donde:
A = absorbancia de la resta entre valores (510 – 700) correspondiente a cloruro de potasio menos la absorbancia de la resta de valores (510 – 700) de acetato de sodio.
MW = tamaño de la molécula de cyanidin-3-glucósido (449.2 g/mol).
DF= factor de dilución (1:100).
E= absorción molar (26,900 L/cm/mg).
Tc= tamaño de la cubeta de la microplaca (0.52).
Capacidad antiradical por ABTS
Se realizó de acuerdo a Kuskoski y colaboradores (2005) (Kuskoski, Asuero, Troncoso, Mancini-Filho, & Fett, 2005), se preparó una solución de ABTS+ (Ácido 2,2’ Azinobis-3-etil-benzotiazolin-6-sulfonico) al 7 mM/L con persulfato de potasio al 2.45 mM/L, se incubó durante 16 h a temperatura ambiente en la oscuridad y transcurrido el tiempo, se diluyó en agua desionizada hasta obtener una absorbancia de 0.7±0.9. Posteriormente se tomaron 20 µL de muestra y 980 µL de la dilución de ABTS+, se dejó reposar 7 min, la Abs se midió a 754 nm (Kuskoski et al., 2005), la cual fue comparada con una curva estándar de ácido ascórbico(0-50µmol/l). La capacidad antioxidante se expresará como µmol de equivalentes de vitamina C por 100 g de jugo (µmol EVC/100 g).
Capacidad antiradical por DPPH
Para la determinación de actividad antirradical se empleó el método DPPH (2,2-Difenil –1-Picril hidrolizado) por Delgado-Andrade y colaboradores (2005) (Delgado-Andrade, Rufian-Henares, & Morales, 2005), el cual es un radical libre estable que en una solución etanólica presenta una coloración violeta intenso, sí a ésta solución se le agrega una sustancia susceptible de atrapar radicales libres (Trólox), el electrón no apareado del DPPH se aparea e inmediatamente presentará una decoloración que puede ir hasta un tono amarillo. Se elaboró la solución de DPPH al 0.07% en metanol y una curva estándar de Trólox, la cual es la molécula de referencia con las siguientes concentraciones en etanol: 0, 50, 100, 200 y 300 μmol Trólox/L, para obtener la curva. Para realizar la técnica para la curva y la muestra de estudio, se vertieron 100 μL de la muestra diluida y 500 μL de la solución de DPPH, se agitaron en vortex y se reposarán a temperatura ambiente durante 60 min, transcurrido el tiempo se centrifugaron a 10,000 rpm/5 min, a 4 °C y se midió la Abs del sobrenadante a 520 nm (Delgado-Andrade et al., 2005). La actividad antioxidante por DPPH se reporta en μmol equivalente de Trólox por 100 g (μmol ET/100 g).
La bioaccesibilidad intestinal de los compuestos antioxidantes y capacidad antioxidante fue determinada mediante una fase inicial de simulación de digestión intraluminal seguida por una fase de diálisis simulando la absorción intestinal. Lo anterior se llevó a cabo utilizando un modelo de digestión in vitro, siguiendo el método descrito por Miller y colaboradores, (1981) (D. D. Miller, Schricker, Rasmussen, & Van Campen, 1981) con algunas modificaciones de Trinidad y colaboradores (1996) (Trinidad, Wolever, & Thompson, 1996) . La bioaccesibilidad intestinal de los compuestos antioxidantes (fenólicos, ácido ascórbico) y de la capacidad antioxidante, fue determinada como la diferencia de los parámetros (polifenoles totales, ácido ascórbico y capacidad antioxidante) en la muestra sin tratamiento, y en la fracción dializada aislada de la muestra.
Fueron homogenizados 500 mg de muestra en 20 mL de agua, y se ajustó a un pH de 2 con HCl 6 M. La muestra fue incubada con 120 µL de una disolución de pepsina (40 mg pepsina -Sigma Aldrich P-7000 por mL de HCL 0,1 M) en un baño con agitación a 37 °C por 2 h. Después de la incubación se agregaron 1,5 mL de una disolución bilis-pancreatina (5 mg de enzima pancreatina P-1750 Sigma Aldrich- mas 25 mg bilis porcina B-8631 Sigma Aldrich- por mL de NaHCO3 0,1 M). Las muestras digeridas por las enzimas fueron colocadas en una bolsa de diálisis tamaño de corte de 12 KDa, y fueron dializadas en una solución de bicarbonato de sodio (pH 7,5) durante 12 h. La figura 10 presenta el esquema de la metodología que se siguió para la determinación de la bioaccesibilidad in vitro de antioxidantes.
Se procedió a obtener los extractos de jugo liofilizado por hexano, acetato de etilo y etanol, mediante la dilución de 500 g de muestra en 1 L del disolvente, posteriormente se agitó, y sometió a filtrado y concentrado en rotavapor.
Los extractos obtenidos, fueron sometidos a separación mediante cromatografía en columna, cromatografía rápida y HPLC, para obtener metabolitos puros. Estas sustancias se analizaron mediante métodos físicos, químicos y espectroscópicos, principalmente Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y 13C, incluyendo experimentos de naturaleza de carbono (APT; Attached Proton Test), acoplamiento entre protones (COSY, correlation spectroscopy; NOESY, Nuclear Overhauser effect spectroscopy), acoplamiento entre protones y carbono trece a uno (HETCOR, heteronuclear correlated spectroscopy; HMQC, Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) y a dos y tres enlaces (HMBC, Heteronuclear Multiple Bond Coherence) (Silverstein, Webster, & KIiemle, 2005).
Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) y una comparación de medias para determinar diferencias entre los tratamientos. Al igual, se realizó un coeficiente de correlación bivariante a nivel p≤ 0.01 por Pearson (r= 0.9 y r= 0.8) para la actividad antioxidante. Todas las pruebas fueron realizadas por triplicado, se obtuvo la media de los resultados y se realizó un análisis del modelo lineal general multivariante asumiendo varianzas iguales por Tukey con el Software SPSS. Las diferencias en p≤ 0.05 fueron consideradas significativas.
Se elaboraron los diferentes jugos de zarzamora; control (CTL), pasteurizado (PAS) y termoultrasonicado (TUS), de los cuales, se obtuvo un rendimiento del 57 ± 1% correspondiente al jugo con color rojo violeta intenso característico del fruto y 43 ± 1% al bagazo. Posteriormente los jugos fueron sometidos a liofilización obteniendo 91 ± 1% de humedad total.
En la tabla 1, se muestran los resultados obtenidos de la actividad antioxidante correspondiente a los jugos de zarzamora.
Tabla 1.Actividad antioxidante de los jugos de zarzamora.
Los valores obtenidos en el jugo de zarzamora fueron de 27 mg AA/100 g. Estos resultados tienden a ser diferentes en comparación con otros estudios, Pantelidis y colaboradores (2006) (Pantelidis et al., 2006), obtuvieron valores entre 14 y 17 mg AA/100 g, mientras que De Souza y colaboradores (2014) (de Souza et al., 2014) , obtuvieron un promedio mayor (52 mg AA/100 g) de contenido de ácido ascórbico.
El ácido ascórbico disminuyó por los tratamientos aplicados, tanto en el jugo pasteurizado como en el termoultrasonicado, aunque en este último la disminución de este compuesto fue más drástica (24%), en comparación con el pasteurizado (9%). Este comportamiento pudiera ser causado a las reacciones de oxidación del ácido ascórbico ocasionada por la temperatura que se utilizó como tratamiento. La aplicación de ambos tratamientos en la conservación del jugo de zarzamora conllevan una temperatura mayor de 45 °C (termoultrasonido 48±2 °C y pasteurización 72 °C). Según diferentes autores, el ácido ascórbico sufre reacciones de oxidación con estas temperaturas alcanzadas (S. H. Lee & G. A. Coates, 2003; Sadilova et al., 2009).
Por otra parte, Tiwari y colaboradores (2009) (Tiwari et al., 2009), sugieren que cuando la termosonicación se lleva a cabo con temperaturas mayores de 45 °C y tiempos prolongados (15–30 min), la degradación del ácido ascórbico aumenta, debido a las condiciones físicas extremas que se producen dentro de las burbujas que colapsan a micro escala durante el proceso de ultrasonicación. Por lo tanto, la combinación de condiciones como la temperatura aplicada, tiempo de tratamiento y cavitación del ultrasonido conllevan a una mayor oxidación de ácido ascórbico.
Con respecto a los valores de fenoles totales, los resultados del jugo de zarzamora fueron de 726 mg EAG/100 g, siendo estos valores mayores que los obtenidos por Isik y colaboradores (2011) (Işık, Şahin, Demir, & Türkben, 2011) en este mismo fruto (435 mg EAG/100 g). Los valores presentados por la muestra control fueron menores, en comparación con el jugo pasteurizado y el jugo termoultrasonicado.
A diferencia del comportamiento del ácido ascórbico, los tratamientos aplicados al jugo de zarzamora presentaron una mayor concentración de compuestos fenólicos totales en comparación con la muestra control, siendo el tratamiento con termoultrasonido el que presentó un mayor incremento de compuestos fenólicos (39%) en comparación con el jugo pasteurizado (9%).
Esta diferencia de incremento de compuestos fenólicos entre los tratamientos, pudiera deberse principalmente a la aplicación de temperatura. Según lo establecido por Rawson y colaboradores (2011) (Rawson et al., 2011), mencionan que a temperaturas de 45 °C se produce una liberación de compuestos fenólicos en un jugo de sandía, debido a la ruptura de estructuras celulares, sin embargo, también establece que a temperaturas cercanas o mayores de 70 °C, puede llegar a existir una degradación de estos compuestos. La temperatura antes mencionada fue aplicada en este estudio, en el que el jugo de zarzamora pasteurizado alcanzó una temperatura de 70 °C transcurridos 30 minutos de proceso.
Esta disminución de compuestos fenólicos ocasionado a los tratamientos de pasteurización también ha sido presentada por Aguilar-Rosas y colaboradores (2007) (Aguilar-Rosas, Ballinas-Casarrubias, Nevarez-Moorillon, Martin-Belloso, & Ortega-Rivas, 2007) en un jugo de manzana, siendo de forma importante esta degradación a la temperatura de 80 °C durante 15 min.
El jugo termoultrasonicado presentó una mayor liberación de compuestos fenólicos (1,011 mg EAG/100 g), lo cual pudo deberse a una efecto sinérgico entre la temperatura alcanzada, tiempo de procesamiento y cavitación ejercida por el tratamiento. Este resultado de liberación de compuestos fenólicos fue similar a lo encontrado en otro estudio en jugo de sandía (Rawson et al., 2011), no obstante, en el presente estudio se utilizó menor temperatura, aunque mayor tiempo de procesamiento.
Los valores correspondientes a antocianinas en el jugo de zarzamora fueron de 106 mg de cyanidin-3-glucósido/100 g. Estos valores fueron mayores a los presentados por Acosta-Montoya y colaboradores (2009) (Acosta-Montoya et al., 2009), de 77 mg de cyanidin-3-glucósido/100 g. La diferencia en estos resultados en el contenido de antocianinas en la zarzamora depende de diferentes factores, tanto genéticos, climáticos, así como el manejo de la cosecha (de Souza et al., 2014) . Los valores encontrados en el presente estudio fueron menores para el jugo pasteurizado (94 mg de cyanidin-3-glucósido/100 g) mientras que el jugo termoultrasonicado, presentó una mayor extracción de antocianinas.
Las antocianinas son compuestos muy inestables, su degradación puede ser producida por el pH, la luz, oxígeno, enzimas, ácido ascórbico y tratamientos térmicos (Tiwari et al., 2009), lo que conlleva a que el tratamiento por pasteurización haya provocado cierta oxidación de las antocianinas.
Los valores obtenidos de antocianinas en el jugo de zarzamora tratado con termoultrasonido (118 mg de cyanidin-3-glucósido/100 g), coinciden con los obtenidos por Ivanovic y colaboradores (2014) (Ivanovic et al., 2014), en donde el mayor rendimiento de extracción y liberación de antocianinas en un jugo de zarzamora ultrasonicado, se presentó en condiciones de tratamiento, 40 °C durante un lapso de 15 min, obteniendo de esta forma, un incremento del 20% de los valores de antocianinas.
Por otra parte, estos resultados fueron mayores a los encontrados por Tiwari y colaboradores (2009) (Tiwari et al., 2009), quienes refirieron valores entre 96 y 99 mg de cyanidin-3-glucósido/100 g, para un jugo de zarzamora ultrasonicado con diferentes tratamientos de superficie respuesta (amplitud del 70%, 25±1 °C, 10 min). Posiblemente, este comportamiento pudo deberse a la diferencia de las temperaturas que se mantuvieron en el presente trabajo (45 °C), mientras que en el estudio referido en comparación, la temperatura durante el proceso fue menor.
Es evidente que la combinación de temperatura aplicada y ultrasonicación pueden ser clave para la extracción de una mayor cantidad de antocianas en el jugo de zarzamora.
La actividad antioxidante en el jugo de zarzamora control (determinada por ABTS), fue de 13 mg VC/100 g, similar a lo reportado por Acosta-Montoya y colaboradores (2009) (Acosta-Montoya et al., 2009). Después de la aplicación de los tratamientos, el jugo pasteurizado fue el que presentó menor actividad antioxidante determinada por ABTS (11 mc VC/100 g), mientras que el jugo termoultrasonicado fue el que presentó una mayor actividad con valores de 44 mg VC/100 g. La actividad antioxidante estuvo correlacionada principalmente con los fenoles totales y antocianinas y en menor medida con la determinación de ácido ascórbico (Tabla 2), posiblemente por la reducción con el ácido ascórbico durante los tratamientos utilizados, como ya se hizo referencia en apartados anteriores.
Debido a que el ácido ascórbico es una vitamina termolábil, como ya se ha mencionado anteriormente, se podría suponer que existió una degradación de los compuestos del jugo pasteurizado comparado con el jugo termoultrasonicado, ya que el tratamiento térmico aplicado (70 °C durante 30 min) utilizado, llegó a oxidar y reducir sus compuestos (Sadilova et al., 2009), principalmente el ácido ascórbico.
Tabla 2.Coeficientes de correlación entre la actividad antioxidante y los compuestos de la zarzamora.
Los valores obtenidos de los jugos de zarzamora en referencia a la actividad antioxidante utilizando como antirradical DPPH, fueron de 1,146 µmol ET/100 g en el jugo control. Estos valores fueron menores que los presentados por Acosta-Montoya y colaboradores (2009) (Acosta-Montoya et al., 2009), quienes cuantificaron la actividad antioxidante utilizando el antirradical DPPH en la zarzamora obteniendo valores de 2,142 µmol ET/100 g.
Sin embargo, los tratamientos utilizados afectaron esta actividad antioxidante, el jugo pasteurizado presentó una mayor actividad antioxidante (1,319 µmol ET/100 g), mientras que el jugo termoultrasonicado, presentó el doble de los valores (2,655 µmol ET/100 g) presentados para el jugo control y pasteurizado. Según diversos autores (Aadil, Zeng, Han, & Sun, 2013; Tiwari et al., 2009; Zafra-Rojas et al., 2013) , establecen que el efecto del ultrasonido puede romper la estructura celular de las vacuolas, afectando de igual forma a la fibra contenida en la fruta y por ende se liberan polifenoles y otros compuestos con capacidad antioxidante.
Estos valores se correlacionaron principalmente con los fenoles totales y con la determinación de ácido ascórbico y en menor medida con las antocianinas totales como se muestra en la tabla 2.
Actividad antioxidante de los jugos digeridos de zarzamora
En la tabla 3, se muestran los resultados de los compuestos antioxidantes y actividad antioxidante de los jugos de zarzamora y después del proceso digestivo in vitro.
Ácido ascórbico
Los valores obtenidos del jugo control de zarzamora (27 mg AA/100) y en el proceso de pasteurización (25 mg AA/100 g) g no presentaron cambios después de la simulación del proceso digestivo. En estudios realizados por Rodríguez-Roque y colaboradores (2015) (115), en jugos de frutas (naranja, kiwi, piña y mango) encontraron que hay una degradación de la vitamina C (entre un 11 y 13 %) después de un proceso digestivo in vitro tanto en jugos sin tratamiento como en aquellos pasteurizados. Por lo tanto se puede sugerir que en el actual trabajo el ácido ascórbico presente en jugo de zarzamora presenta cierta estabilidad del ácido ascórbico durante el tránsito intestinal.
Por otra parte, como ya mencionamos el ácido ascórbico fue menor en la muestra con tratamiento de termoultrasonido, sin embargo después del proceso digestivo el contenido de esta vitamina se incrementó en un 16 % considerando la muestra sin el proceso digestivo. La estabilidad que se presenta en los jugos de zarzamora después del tratamiento térmico y después del proceso digestivo pudiera deberse a la presencia de pigmentos y fenoles, compuestos que poseen una alta cantidad de ácido ascórbico y por causa del ultrasonido pueden romperse las vacuolas que los contienen y como efecto la liberación de dichos compuestos (N. J. Miller & Rice-Evans, 1997; Noguer et al., 2008) . Por otro lado, Según algunos autores la combinación de condiciones del tratamiento de termoultrasonicación, pudieron jugar un papel importante para la liberación y conservación de ciertos compuestos bioactivos como el ácido ascórbico.
La ingesta diaria recomendada de vitamina C varía entre 25 y 75 mg AA para niños y adultos y 130±5 mg AA en caso de embarazadas y lactantes (Casanueva, Kaufer, & Perez, 2008). Un jugo de zarzamora de 250 mL, contendría aproximadamente 125 mg AA, un equivalente de dicho jugo aportaría el 100% de los requerimientos diarios de vitamina C para una persona. Por otra parte, la bioaccesibilidad del ácido ascórbico contenido en los jugos de zarzamora CTL y PAS no se vería afectada, sin embargo, el jugo TUS presenta un incremento del 16% en su fracción bioaccesible.
Fenoles totales
El jugo de zarzamora presentó valores de 726 mg EAG/100 g, sin embargo el procesamiento de estos por PAS y TUS, conllevó un incremento de estos compuestos. Al someter los diferentes tratamientos a un proceso digestivo se presentó un menor valor de compuestos fenólicos (entre 17 y 30%), siendo mayor la pérdida en el jugo TUS.
En diferentes estudios en frutos como granada (Sengul, Surek, & Nilufer-Erdil, 2014), uvas (Tagliazucchi, Verzelloni, Bertolini, & Conte, 2010) y bebidas de frutas (Cilla, González-Sarrías, Tomás-Barberán, Espín, & Barberá, 2009), que fueron sometidos a proceso digestivo in vitro, demostraron que existió una degradación del 80%, 62% y 47%, respectivamente. El metabolismo de los polifenoles inicia principalmente en el estómago y la mayor parte en el intestino delgado donde se presentan algunas reacciones para la liberación de estos compuestos, la transición del medio estomacal al intestinal induce al cambio estructural de las compuestos fenólicos y podría atribuirse a la ionización de los grupos hidroxilos, siendo las agliconas y algunos glucósidos los compuestos que pueden ser absorbidos en el intestino delgado (Tagliazucchi et al., 2010).
Los valores de los jugos de zarzamora después de la digestión in vitro, pudieron tener relación con la transición de la acidez gástrica hacía medio alcalino intestinal, la polaridad de los fenoles (Liang et al., 2012) y la barrera epitelial (membrana de celulosa semipermeable) (Bouayed, Hoffmann, & Bohn, 2011), razones por la que existe una disminución de la cantidad de bioaccesibilidad de los polifenoles totales.
La cantidad encontrada de compuestos fenólicos después de la simulación gástrica in vitro, fue similar entre el jugo control y el PAS, indicando finalmente que hay una mayor liberación de compuestos de menor tamaño por el TUS al igual que una mayor bioaccesibilidad de estos compuestos.
La cantidad de compuestos fenólicos en una porción de jugo de zarzamora (250 mL) PAS y TUS, contendría entre 2.9 y 3.5 g EAG, respectivamente. Diversos autores establecen que siguiendo la recomendación de consumir 5 frutas y vegetales diariamente, se aportaría una cantidad de polifenoles mayor de 0.5 g (Chun et al., 2005; Williamson & Holst, 2008) , lo cual sería fácil aportar la dosis diaria con una ración de 250 mL de jugo de zarzamora.
Tabla 3. Comparación de actividad antioxidante de los jugos de zarzamora después de su digestión intestinal in vitro (100 g de muestra bs).
Antocianinas
Como un ingrediente común en los alimentos, la gente puede ingerir una cantidad importante de antocianinas a través del consumo de verduras, frutas, vinos y otros alimentos, ya que dichos compuestos contiene cantidades importantes de pigmentos y capacidad antioxidante (Manach, Scalbert, Morand, Remesy, & Jimenez, 2004; Srivastava, Akoh, Fischer, & Krewer, 2007) . Sin embargo, para lograr efectos beneficiosos de salud, los compuestos bioactivos deben ser bioaccesibles, absorbidos eficazmente desde el intestino a la circulación y disponibles a la ubicación adecuada dentro del cuerpo (Mane et al., 2007) .
Los valores correspondientes a antocianinas en el jugo control de zarzamora fueron de 106 mg A/100 g, siendo estos valores mayores (35%) que los obtenidos por el jugo control posterior a la simulación gastrointestinal. Diversos estudios sobre la bioaccesibilidad in vitro de antocianinas de la granada (Sengul et al., 2014) y variedades de manzanas (Bouayed et al., 2011), demostraron que la degradación de dichos compuestos en estos frutos fue importante, ya que existió una degradación del 88% y 100%, respectivamente, en comparación con los valores iniciales de las muestras. Mismos autores refieren que existe una mayor degradación de las antocianinas a productos secundarios como las chalconas durante la digestión pancreática que en la digestión gástrica, razón por la que podría existir una disminución significativa en sus valores, al igual, a que las pruebas para determinar antocianinas totales no pudieron identificar tales monómeros por lo que no pudieron ser registradas.
Como se había mencionado anteriormente, las antocianinas son compuestos muy inestables, por lo que en adición de un tratamiento térmico, la digestión gástrica y pancreática de la bioaccesibilidad in vitro pudieron haber disminuido considerablemente sus valores. Razón por la que las muestras TUS y PAS digeridas presentaron entre 30 y 35%, respectivamente, menor cantidad de antocianinas que en los jugos liofilizados. Sin embargo, ambos tratamientos presentaron una bioaccesibilidad intestinal del 65 - 70%, valores importantes para los jugos de zarzamora en comparación con la degradación total de los estudios anteriormente citados.
Actividad antioxidante por ABTS●+ y DPPH
La actividad antioxidante del jugo de zarzamora fue de 13 mg VC/100 g, después del proceso digestivo estos valores se incrementaron en un 100%. Por otra parte, un estudio realizado por Wootton y colaboradores (2011) (Wootton-Beard, Moran, & Ryan, 2011), en diversos jugos a base de vegetales, encontraron porcentajes de inhibición del antirradical ABTS del 22 al 92% después de la digestión in vitro de dichos jugos. Se podría sugerir de esta forma que la vitamina C contenida en la zarzamora presenta mayor bioaccesibilidad posterior al proceso de digestión in vitro.
La muestra PAS presentó un comportamiento similar a la muestra CTL, ya que alcanzó un incremento en sus valores de ABTS mayor del 100% posterior de la simulación de digestión in vitro. Por otra parte, el jugo TUS exhibió resultados diferentes a las muestras CTL y PAS, ya que los valores antes y después de la digestión fueron similares. Se sugiere que existió la estabilidad del ácido ascórbico después del proceso de digestión, la concentración de compuestos polifenólicos y pigmentos pudieron ejercer un efecto protector (Noguer et al., 2008) , retardando de esta forma la descomposición oxidativa de la vitamina C.
Los valores obtenidos del jugo de zarzamora en referencia a la actividad antioxidante utilizando DPPH como antirradical, fueron de 1,146 μmol ET/100 g, estos valores fueron menores en comparación con la muestra digerida, ya que presentó un incremento mayor del 100%. Por otra parte, estudios han demostrado que existe una disminución de los valores de DPPH de diversos frutos después de la bioaccesibilidad intestinal in vitro, 15% para una bebida a base de jugos de frutas (Rodríguez-Roque et al., 2015), 46% para la aronia (Stanisavljević et al., 2015) y 68% para el tomate morado (Li, Deng, Liu, Loewen, & Tsao, 2014) .
La muestra PAS exhibió un comportamiento similar al jugo CTL, ya que los valores reportados después de la simulación de digestión in vitro, presentaron un incremento mayor del 100% de sus resultados. Sin embargo, un estudio realizado por Rodriguez-Roque (2015) (Rodríguez-Roque et al., 2015), en una bebida con tratamiento de pasteurización a base de frutos (naranja, kiwi, piña y mango), manifestaron que existió una disminución de sus valores alrededor del 35% después de la digestión intestinal in vitro. Cabe mencionar que la pasteurización con temperaturas mayores a 90 °C puede degradar compuestos con capacidad antioxidante (Sadilova et al., 2009), razón por la que en el presente trabajo no existió degradación de los compuestos con capacidad ya que se utilizaron temperaturas menores (70 °C).
La muestra TUS presentó comportamiento diferente a la muestra CTL y PAS, ya que sus valores disminuyeron 11% después de la bioaccesibilidad intestinal in vitro. Estos resultados podrían ser comparados con otras tecnologías emergentes, como es el caso procesamiento de altas presiones y campos eléctricos de alta intensidad, ya que un estudio presentó que existió una disminución del 14% y 19%, respectivamente, en referencia al antirradical DPPH posterior a la digestión de su muestra a pesar de que en su tratamiento no emplean el uso de temperaturas elevadas (Rodríguez-Roque et al., 2015). Este fenómeno puede estar relacionado a la unión de compuestos fenólicos solubles a los componentes del alimento, principalmente por unión covalente y enlace iónico en el medio acuoso en el que se presentó la muestra estudiada.
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Correo de Correspondencia: baronruiz7@hotmail.com
[a] Alumno de la Maestría en Ciencias Biomédicas y de la Salud ICSa, UAEH,
[b] Profesor Investigador del Área Académica de Nutrición, ICSa UAEH.