Se evaluó el efecto antimicrobiano de hipoclorito de sodio 200 ppm y ácido acético al 5% en fresa contra E.coli O157:H7, L. monocytogenes, S. Typhimurium y S. flexneri. La desinfección de las fresas se realizó inoculando un área marcada con una concentración conocida de cada uno de los patógenos lavados por centrifugación, las fresas fueron almacenadas a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de este tiempo el área inoculada se cortó con bisturí estéril, se homogenizó la muestra con peptona y se sembró en Agar para Métodos Estándar con rifampicina (AME+R), se incubaron las cajas Petri por 24 h a 32 ± 2 ºC. Transcurrido este tiempo se procedió al conteo para observar la eficiencia de los dos desinfectantes. El hipoclorito de sodio a 200 ppm y el ácido acético al 5 % no lograron reducir ni tan solo 0.5 Log UFC/cm2 en cada uno de los patógenos. Es necesario buscar otras alternativas que aseguren la correcta desinfección de las fresas.
Palabras clave:E. coli O157:H7; S. Typhimurium; L. monocytogenes; S. flexneri; Fresa; Antimicrobiano.
In this research was evaluated the efficiency of sodium hypochlorite (200 ppm), acetic acid (5%) against Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium and Shigella flexneri inoculated in strawberry. To determine the efficiency was inoculated 10 µL of each pathogen in determinate are in the strawberry and was storage at room temperature during 30 minutes. After that the inoculation area was cut with a sterile knife and was homogenized in a plastic bag with peptone water. Then the microorganism was counted using standard method agar with rifampicina at 200 ppm. The plates were stored at 352°C for 24 to 32 h. The results shown that any disinfectant was effective due to didn’t reduce neither 0.5 Log CFU/cm2. It’s necessary to search news disinfects that had a strong inhibition against these pathogens in strawberry.
Keywords:E. coli O157:H7; S. Typhimurium; L. monocytogenes; S. flexneri; strawberry, antimicrobian.
Las Enfermedades Transmitidas por los Alimentos (ETAs) son un problema de salud pública mundial, en general es más acentuado en los países en desarrollo como México (CDC, 2009). La fresa tiene la posibilidad de contaminarse con patógenos debido a las condiciones en las que es cultivada. Un brote de origen alimentario de E. coli O157:H7 en el estado de Oregón, en julio y agosto de 2011 se remonta a fresas frescas contaminadas, que enfermaron a 15 personas, 6 hospitalizados, e indujo el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) en cuatro pacientes. Murieron dos individuos que sufrieron de SHU (FDA, 2011). En respuesta a la contaminación por patógenos a la que están expuestas las frutas, se han utilizado antimicrobianos o desinfectantes químicos para reducir la carga microbiana (Ruiz et al., 2007). Sin embargo hay estudios que han demostrado que los antimicrobianos químicos comúnmente utilizado para inhibir o eliminar microorganismos patógenos son limitados o ineficaces (Castro-Rosas & Escartín, 1999); un ejemplo claro es el hipoclorito de sodio, el cual es el agente desinfectante más utilizado para la reducción de patógenos en frutas y verduras, enteras y recién cortadas. Las concentraciones recomendadas son de 50 a 200ppm (Beuchat, 1998). Sin embargo, la eficacia es limitada en la reducción de poblaciones bacterianas (Parish et al., 2003). El objetivo del estudio fue determinar el efecto antimicrobiano de hipoclorito de sodio, ácido acético en la reducción de E.coli O157:H7, S.Typhimurium, L. monocytogenes y S. flexneri sobre fresa (Fragaria x ananassa).
2.1 Fresa
Se compraron fresas en la central de abasto de la ciudad de Pachuca, Hidalgo. Las fresas fueron manejadas en condiciones asépticas y transportadas al laboratorio el mismo día de la compra. Estas fueron mantenidas a temperaturas de 3-7 ºC hasta su uso.
2.2 Cepas bacterianas
Se trabajó con cepas de E. coli O157:H7 (Gómez et al., 2013), S. Typhimurium (ATCC 14028), L. monocytogenes (ATCC 19115) y S. flexneri (ATCC 12022). A partir de las cepas nativas se obtuvieron cepas mutantes con resistencia al antibiótico Rifampicina (R+) (Castro-Rosas et al., 2010).
2.3 Preparación de cepas bacterianas
Las cepas de estudio se activaron en 3 mL de caldo soya Tripticaseína (CST, Bioxon, México) con incubación de 35 ± 2 ºC durante 24 h, los cultivos se lavaron dos veces en peptona de caseína (Bioxon, México) por centrifugación a 3500 rpm durante 20 min y se resuspendió los pellets en peptona de caseína estéril.
2.4 Adherencia bacteriana
Una muestra de 10 µl fue tomada de la primera dilución de cada cultivo lavado, y se inoculó sobre las fresas y fueron almacenadas a temperatura ambiente. Se efectuó recuento a los 0,30 y 60 min de contacto. Después de cada tiempo se cortó el área inoculada y se lavó con agua destilada durante 30 s, la parte de la fresa lavada se introdujo en una bolsa de plástico, se adicionó 20 mL de diluyente de peptona de caseína y se homogenizó manualmente durante 1 min. El conteo se efectuó mediante la técnica de vaciado en placa empleando Agar Métodos Estándar con rifampicina (AME+R) e incubando a 35º/24-48h.
2.5. Efecto de desinfectantes
Se preparó hipoclorito de sodio a 200 ppm, ácido acético al 5%, y agua destilada como control. Se inoculó 10 µl de la primera dilución de cada patógeno lavado en fresas de tamaño semejante (se marcó el área de inoculo y se realizó por triplicado). Cada cepa bacteriana se dejó durante un tiempo de adherencia de 30 min. Transcurrido este tiempo se cortó el área de inoculo y se lavó con agua destilada para eliminar las bacterias que no se adhirieron. A cada uno de los trozos de fresa se le colocó 20 µl de cada una de las soluciones desinfectantes durante 10 min, se enjuagó durante 30 segundos con agua destilada, se colocó en una bolsa estéril, a la cual se le agregó 10 mL de peptona. Se homogenizó la muestra durante 1 minuto. De la muestra ya homogenizada, se sembró por vaciado en placa en agar para métodos estándar con rifampicina (AME+R), las cajas Petri se dejaron incubar durante 24 hrs a 35 ± 2 °C.
Todos los experimentos fueron repetidos tres veces. Los resultados obtenidos fueron sometidos al programa estadístico NSCC 2007 (NCSS, Kaysville, Utah, USA) para el análisis de varianza de una sola vía (ANOVA). Se realizó comparación de medias con la prueba de Tukey. Todo esto con un nivel de significancia de 0.05 Las medias cuantitativas fueron transformadas logarítmicamente para los análisis.
4.1 Adherencia bacteriana
La respuesta de los microorganismos a los tratamientos de lavado y desinfección depende en parte de las condiciones ambientales que afectan la adherencia y la sobrevivencia en superficies de los productos. Entre los principales factores que limitan la eficacia del proceso de desinfección está la fuerza y la rapidez de adherencia microbiana, la inaccesibilidad a los sitios de unión, fijación y crecimiento en los cortes y perforaciones, la internalización de los contaminantes microbianos en los tejidos vegetales, y la formación de biopelículas (Ruiz et al., 2007). Por lo antes mecionado es de importancia determinar la capacidad de adherencia de los microorganismos patógenos en frutas y hortalizas, ya que esto permitirá evaluar la capacidad de desinfección de diferentes sustancias. No hay reportes sobre adherencia de microorganismos patógenos en la superficie de fresa. Es por ello que se determinó la adherencia de los 4 microorganismos de ensayo sobre fresa a temperatura ambiente y se efectuó recuento a los 0, 30 y 60 min de contacto (Tabla 1).
En la tabla 1 se puede observar que todos los microorganismos se adhirieron a la fresa, incluso desde el tiempo 0 de contacto. El análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) presentó diferencias significativas entre los tratamientos con una P < 0.05. Se realizó comparación de medias por la prueba de Tukey para cada uno de los patógenos. En esta prueba se observó que no hay diferencia significativa para los tiempos 0 y 30 min de adherencia para E. coli O157:H7, mientras que para L. monocytogenes, S. Typhimurium y S. flexneri está prueba presentó diferencia significativa en los 3 tiempos de adherencia. El microorganismo que tuvo mayor adherencia en la superficie de fresas fue L. monocytogenes, presentando un inoculo final de 4.8, 4.5 y 4.1 Log10 UFC/cm2, para los tiempos de 0, 30 y 60 min, respectivamente. El microrganismo que mostró menor capacidad para adherirse fue S. flexneri con inoculo final de 4.1, 3.7 y 2.4 Log10 UFC/cm2 a los 0, 30 y 60 min de contacto, respectivamente.
Tabla 1. Capacidad de adherencia de bacterias patógenas en fresa.
| Microorganismo | Tiempo(min) | Inoculo inicial 1 | Inoculo final 1 |
| L. monocytogenes | 0 | 5.7±0.04 | 4.8±0.1a |
| 30 | 4.5±0.1b | ||
| 60 | 4.1±0.1c | ||
| S. flexneri | 0 | 5.9±0.04 | 4.1±0.1a |
| 30 | 3.7±0.1b | ||
| 60 | 2.4±0.5c | ||
| E. coliO157:H7 | 0 | 5.9±0.04 | 4.1±0.2a |
| 30 | 4.3±0.1a | ||
| 60 | 2.8±0.2b | ||
| S. Typhimurium | 0 | 5.1±0.1 | 4.3±0.02a |
| 30 | 3.9±0.05b | ||
| 60 | 3.7±0.1c |
1 Media de 3 réplicas del contenido de microorganismos expresado en Log10 UFC/cm2 ± desviación estándar. a,b.c Valores con letras diferentes en la misma columna por patógeno expresan diferencia significativa con α= 0.05, Prueba de Tukey
Existen algunos reportes sobre adherencia bacteriana en otras frutas y verduras como zanahorias, lechuga, manzana (Ruiz et al., 2007). El inoculo final obtenido en fresa en el tiempo 30 para Salmonella spp es similar al reportado previamente para zanahorias (Ruiz et al., 2007). La adherencia de E. coli O157:H7 en la superficie de lechuga no coincide con el obtenido para fresa (Hassan & Frank, 2004).
4.2 Efecto de desinfectantes
En esta prueba se observó que el control (Agua destilada) es diferente significativamente del resto de los tratamientos para E. coli O157:H7 y L. monocytogenes, mientras que el agua destilada (control) no tuvo diferencias significativas con el Hipoclorito de sodio 200 ppm para S. Typhimurium. Esto quiere decir que el hipoclorito tuvo una reducción igual que el agua destilada. Finalmente para S. flexneri el control es igual al hipoclorito de sodio 200 ppm, y ácido acético 5% como se muestra en la tabla 2.
Cabe destacar que el hipoclorito de sodio solo redujo 0.4, 0.3, 0.1 y 0.1 Log10 UFC/cm2 para E .coli O157:H7, L. monocytogenes, S. Typhimurium y S. flexneri, respectivamente, mientras que el ácido acético mostró reducciones de 0.3, 0.3, 0.3 y 0.2 para E. coli O157:H7, L. monocytogenes, S. Typhimurium y S. flexneri, respectivamente, estos valores son comparados con el control en las 4 bacterias de ensayo. Esta reducción es insuficiente según la normativa nacional e internacional.
Tabla 2. Efecto antimicrobiano de dos desinfectantes comerciales sobre bacterias patógenas adheridas a fresa.
| Tratamientos | E. coliO157:H7 1 | L. monocytogenes 1 | S. Typhimurium 1 | S .flexneri 1 |
| AD | 4.5±0.01a | 4.5±0.1a | 4.1±0.02a | 4.1±0.03a |
| NaOCl 200 ppm | 4.1±0.03b | 4.2±0.04b | 4.0±0.04a | 4.0±0.1a |
| CH3COOH 5% | 4.2±0.02c | 4.2±0.1b | 3.8±0.1b | 3.9±0.1a |
AD= Agua destilada, NaOCl = Hipoclorito de sodio, CH3 COOH= Ácido acético. a,b.c Valores con letras diferentes en la misma columna por patógeno expresan diferencia significativa con α= 0.05, Prueba de Tukey
Existen estudios en los que se han empleado una concentración muy elevada de hipoclorito y se ha conseguido una reducción significativa pero no se logra la eliminación total de los microorganismos patógenos. Beuchat en 1998, mostró que la máxima reducción de las poblaciones de patógenos al humano en manzanas, jitomates y lechugas fue de 2.3 Log UFC/cm2 después de la inmersión en soluciones de 2000 ppm de hipoclorito de sodio durante 1 minuto. Hay que mencionar que esta concentración tan elevada de hipoclorito de sodio en el agua de lavado causa problemas sensoriales en el producto y además organizaciones como la FDA recomiendan el uso de 50-200 ppm de hipoclorito de sodio (FDA, 2001), por lo tanto esta concentración utilizada rebasa los límites permitidos. Por todo lo mencionado acerca del limitado uso de agentes químicos, la industria de productos de frescos y mínimamente procesados se beneficiaría en gran medida mediante la búsqueda de alternativas al hipoclorito de sodio y al ácido acético, para la desinfección de los productos frescos.
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Ruiz, C.S., Acedo, F.E., Díaz, C.M., Islas O.M.A., González, A.G.A. (2007). Efficacy of sanitizers in reducing Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. And Listeria monocytogenes populations on fresh- cut carrots. Food. Control. 18: 1383-1390.
[a]Instituto de Ciencias Agropecuarias, Rancho Universitario, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Av. Universidad Km. 1, Ex Hacienda Aquetzalpa, Apartado Postal No. 32, Tulancingo, Hgo, Mexico.
[b]Centro de Investigaciones Químicas, Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Centro Universitario, Carretera Pachuca-Tulancingo Km. 4.5, 42183 Mineral de la Reforma, Hidalgo, Mexico.
[1]lizbeth_portillo07@hotmail.com
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